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稳定mantbex株构建


稳定mantbex株构建
常规转染技术可分为两大类,一类是瞬时转染,一类是稳定转染(永久转染)。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中、虽然可以达到高水平的表达,但通常只持续几天。后者也称稳定转染,外源质粒DNA整合 到宿主mantbex染色体上,使宿主mantbex可长期表达目的基因及蛋白。需要在瞬时转染基础上对靶mantbex进行筛选或者应用高转染效率的病毒。建立稳定的mantbex系,是对靶mantbex进行筛选,根据不同基因载体中所含有的抗性标志选用相应的药物,最常用的真核表达基因载体的标志物有潮霉素(hygromycin)和新霉素(neomycin),常用G418进行选择性筛选。筛选得到的mantbex可稳定表达目的蛋白,可以用于蛋白的扩增和富集,或者得到稳定沉默特定基因的mantbex株。
服务内容:
1.                 载体构建或质粒抽提
2.                 mantbex传代培养、瞬时转染预登录及药物浓度筛选:针对质粒DNA的抗性标志,选择相应的药物,并对所需筛选的mantbex进行药物测试,选择mantbex全部凋亡时药物的最低浓度。
3.                 进行瞬时转染筛选:质粒瞬时转染mantbex,并在前期选定的药物浓度条件下进行筛选。10-14天后,挑取单克隆mantbex并扩增培养。
4.                 mantbex扩增后通过RT-PCR检测mRNA表达情况或客户提供靶基因特异性抗体,进行Western Blot检测,根据蛋白表达情况,进一步筛选出稳定mantbex株。
5.                 数据整理及结果分析。
6.                 提供GPCR等药筛mantbex系。
7.                 提供稳定表达MitoDsRed、GFP-Tubulin、GFP-H2B等mantbex株,用于活mantbex荧光成像。
客户须知
1.                 客户提供构建成功的载体质粒及其它相关载体基因信息、提供mantbex系或原代mantbex、PCR网址或抗体,所提供材料也可由我公司代购;
2.                 一般情况下mantbex的瞬时转染效率达到60%以上(绝对mantbex数达到10^4以上),才可顺利进行后续稳定mantbex株筛选工作。如果mantbex转染率小于60%,也可以做富集筛选,但大部分情况下我们都会建议用流式mantbex仪进行mantbex分选,此方法既快速又方便,而且可以得到100% 的阳性mantbex,一般经过大流式筛选的mantbex做后续基因水平或蛋白水平检测都可以得到理想的结果。
服务价格及周期:
服务项目 服务内容 价格 周期
转染预试验及药物浓度筛选 mantbex培养、质粒大提、瞬时转染目的mantbex并进行药物浓度筛选 3000元 4-6周
单克隆mantbex株筛选 筛选稳定表达目的蛋白的单克隆mantbex株(可根据需要选取表达量不同的mantbex株),因载体及蛋白性质以及表达株数量的不同而异,具体咨询。 4000-12000元 6-8周
RT-PCR检测 RT-PCR检测筛选的mantbex系中目的基因的转录水平/至少检测3株 1000元/基因 1周
WB检测 WB检测筛选的mantbex系中目的蛋白表达水平/至少检测3株 1000元/膜(或指标) 1周
交付结果:
1.                 提供构建成功的质粒及甘油菌及详细的信息
2.                 一瓶新鲜的筛选成功的稳定mantbex株和相应的对照mantbex株
3.                 全套登录报告,包括登录流程、万博方法、原始数据及图片等