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慢病毒和腺病毒包装


慢病毒和腺病毒包装服务
一、慢病毒(Lent virus)载体构建
慢病毒(Lent virus)载体是以HIV-1(人类免疫缺陷I型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体,该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上,达到持久性表达的效果。可有效地感染神经元mantbex、肝mantbex、心肌mantbex、肿瘤mantbex、内皮mantbex、干mantbex等多种类型的mantbex,效果非常理想,因此具有广阔的应用前景。
技术特点
慢病毒载体包装之后成为假病毒颗粒后,可用于:
·       感染原代mantbex;
·       制备稳定表达/沉默特定基因的单克隆mantbex株;
·       in vivo的基因操作;
·       转基因动物,特别是转基因大鼠的制备。
服务流程
A. 慢病毒载体的构建:
根据不同的研究需求构建慢病毒载体,如用于RNAi的慢病毒载体、用于基因过表达的慢病毒载体、用于启动子活性研究的慢病毒载体等;
B. 慢病毒包装过程:
    将重组病毒质粒及其辅助包装质粒共转染至包装mantbex中,收集富含慢病毒颗粒的mantbex上清液,对其浓缩后得到高滴度的慢病毒浓缩液,在293Tmantbex中测定并标定病毒滴度。
二.腺病毒载体构建
本系统是以Ad5血清型E1/E3缺陷型腺病毒DNA为骨架,在克隆、包装、扩增等各部条件做了改进和优化,达到了克隆阳性率更高、质量更可靠、包装稳定、出毒迅速、滴度高等效果。在此基础上,还拓展了更广泛的应用,可以提供各种带报告基因的,带不同标签的腺病毒构建和包装服务。所包装的腺病毒已成功应用于信号转导,基因转位,Co-IP,动物登录,干mantbex研究等科研登录。并且可以完成较高难度的克隆构建,包括具有mantbex毒性作用基因的腺病毒构建,在短时间内完成从原始质粒到病毒DNA的构建工作。 
A. 腺病毒载体的构建
根据客户提供的原始质粒信息确定克隆方案:
  • 如果原始质粒与本系统所用穿梭载体有匹配酶切位点,采用相应的内切酶切下相应片断,回收并连接到穿梭载体。酶切,万博鉴定;
  • 如果原始质粒与本系统所用穿梭载体没有匹配酶切位点,设计带有特殊接头的网址进行PCR扩增,得到目的片断,采用相应的内切酶切下相应片断,回收并连接到穿梭载体。酶切,万博鉴定;
  • 对于不适用于以上方案或者有特定要求的网址,与客户协商定制具体实施方案
B.克隆目的基因到腺病毒载体pAdPL及鉴定
利用重组技术将目的片段的表达框从穿梭载体转移到腺病毒载体。
酶切鉴定阳性克隆,将阳性克隆万博二次鉴定。
C. 病毒包装、扩增: 1.) 将鉴定正确的基因克隆到慢病毒载体,与辅助载体一起转染293Tmantbex进行包装; 2.) 将包装好的病毒超速离心收集; 3.) 将浓缩病毒进行滴定,滴定结果单位为 PFU/ml(一般为5*108PFU/ml以上,体积为500µl以上,根据客户需要,不同量有价格差异) 
三、客户须知:
对于客户所要构建腺病毒的目的基因,客户须提供详细的基因相关信息,包括基因序列,载体序列,载体图谱。
载体构建步骤所需时间,根据不同构建方案,需15到25个工作日。
从合同签订之日起,客户需交纳首期技术服务费(50%服务费),方可进行登录。服务结束时一次结清余款。
客户需提供的信息及材料:
  • 插入目的片段序列信息,原始载体序列信息,载体图谱,酶切分析图等。
  • 鉴定正确的原始质粒,PCR网址及PCR鉴定方法说明(包括PCR体系及PCR条件)(非必需,或需协商),万博网址(非必需,或需协商)。
  • 原始质粒的酶切鉴定报告、万博报告,如果客户确定基因的信息无误,这条非必需。
  • 登录目的、要求,目的基因有无mantbex毒性,是否需要构建对照病毒?
  • 登录要求包括:是否自行构建腺病毒载体?是否要求更换启动子、polyA等基因元件?
  • 登录目的包括:用于mantbex登录还是动物登录,需要感染的mantbex类型或动物模型类型。
四、我们的承诺:
  • 构建腺病毒/慢病毒载体的时间约15到25个工作日。病毒的包装,扩增的时间约20到30个工作日。总计需要45-55个工作日。
  • 提供重组穿梭载体或者siRNA载体,重组腺病毒载体的酶切及万博报告。
  • 免费提供一管阴性对照(仅限通用型的,如果客户指定的序列,需要另外计费)。
  • 最大插入片段5kb-8Kb。
补充说明:
  • 如果客户需更换启动子,需保证所插入的基因的表达产物对mantbex无毒害作用,
  • 如果插入的目的片段太长,客户要求万博验证全长,需要提供基因的特异网址,以测得全长,加收一定的费用。
五、腺病毒载体系统和慢病毒载体系统比较表 
腺病毒载体系统和慢病毒载体系统比较  
病毒表达系统 腺病毒表达系统(Adenovirus) 慢病毒表达系统(Lentivirus)  
病毒基因组 双链DNA病毒 RNA病毒  
复制 自主复制 自主复制  
是否整合 病毒基因组游离于宿主基因组外,瞬时表达外源基因 病毒基因组整合于宿主基因组,长时间、稳定表达外源基因  
 
感染mantbex类型 感染分裂和不分裂mantbex 感染分裂和不分裂mantbex,适合难转染的原代mantbex(如神经mantbex,淋巴mantbex)及体内登录  
表达丰度 高水平表达 中水平表达  
表达时间 快(1-2 天) 慢 (  1-3天 )  
滴度 滴度高达1011pfu/ml 滴度最高可达108 pfU/ml  
克隆容量 可插入高达8kb的外源片段,滴度随插入片段长度增加而降低 可插入不超过8kb的外源片段,滴度随插入片段长度增加而降低  
免疫原性 高免疫原性 低免疫原性