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Western Blot


Western Blot
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        蛋白印迹(Western Blot) 是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂网址中的某种蛋白的方法,用于检测经电泳或斑点杂交后固定于膜上的蛋白质的检测。特异、稳定的液态酶标抗体和相应的底物,保证了快速、准确的检测;而避免了放射性物质的使用,现已成为蛋白分析的一种常规技术,对蛋白进行定性和半定量分析。
操作流程
  1. 蛋白质抽提
  (1) 组织网址,取适合量的新鲜组织网址或正确保存的组织网址(非常重要),加1ml 含蛋白酶抑制剂的总蛋白抽提平台或其它蛋白提取平台,匀浆后抽提总蛋白或核、膜蛋白。
  (2) mantbex网址,每份网址取1×106~1×107mantbex,用PBS清洗mantbex,去PBS加0.1-1ml含蛋白酶抑制剂的总蛋白抽提平台或其它蛋白提取平台抽提总蛋白或核、膜蛋白。
  2. 蛋白质定量:BCA蛋白检测平台检测蛋白的浓度。
  3. 变性聚丙烯酰胺不连续凝胶电泳(SDS-PAGE),用微量加样枪准确加样到相应的加样孔中,安装电泳分离蛋白。
  4. 蛋白转移到硝酸纤维膜或PVDF膜上。按Bio-Rad蛋白转移装置说明组装滤纸凝胶纤维素夹层,30mA恒流条件下,4℃转移过夜。
  5. 膜的封闭和抗体孵育
  (1) 膜在5%BSA平台中室温孵育1小时以封闭膜上的非物异结合。
  (2) 封闭过的膜加入一级抗体室温孵育膜1.5h,抗体抗原结合。
  (3) 加入HRP标记的二级抗体以结合一级抗体及HRP标记的抗mantbex素抗体以结合万博量标准,室温孵育膜1小时,加入HRP标记的GAPDH/b-actin抗体可以同时检测GAPDH/b-actin含量。
  6. 结果检测:化学发光法检测,膜与化学发光底物孵育,经X光胶片曝光显影。 
 
收费标准:1000元/膜
客户提供
1、 第一抗体
         建议客户定购国外公司质量有保证的一抗,以国外文献中应用的相关第一抗体为佳。如Abcam Cell signaling technology, Cayman Chemical, Santan Cruz, Zymed等著名抗体公司产品,本公司可代为订购,质优价廉!
2、 登录样本
    同时希望客户能提供相应的背景材料以利登录顺利完成,背景材料包括:样本描述,目的蛋白相关资料,必要的相关登录设计内容如阳性对照等等。
3、样本要求
  a、裂解网址总蛋白量>500ug/网址。
  b、mantbex网址总蛋白浓度>1mg/ml。
  c、组织网址总蛋白浓度 10-15mg/ml。

终产品
1、 完整的登录报告,包括登录方法,登录步骤,登录图片,登录结果和相关数据